產(chǎn)品信息

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

鬼筆環(huán)肽（Phalloidin）的結(jié)合阻止絲狀肌動(dòng)蛋白（微絲）的解離，穩(wěn)定微絲結(jié)構(gòu)，從而破壞微絲的聚合-去聚合的動(dòng)態(tài)平衡。此特性使得肌動(dòng)蛋白聚合發(fā)生的臨界濃度（CC）降至＜1μg/mL，因此，可用作一種聚合促進(jìn)劑。此外，鬼筆環(huán)肽還可抑制F-actin的ATP水解活性。

本品為鬼筆環(huán)肽- TRITC（四甲基異硫氰酸羅丹明）標(biāo)記探針會(huì)選擇性地結(jié)合F-肌動(dòng)蛋白。以納摩爾濃度使用，鬼筆環(huán)肽衍生物是方便的探針，用于標(biāo)記，鑒定和定量甲醛固定和透化組織切片中的F-肌動(dòng)蛋白，細(xì)胞培養(yǎng)物或無(wú)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。肌動(dòng)蛋白是一種球狀的，大約42kDa的蛋白質(zhì)，幾乎存在于所有真核細(xì)胞中。 它也是最高度保守的蛋白質(zhì)之一，與藻類和人類不同的物種相差不超過(guò)20％。 肌動(dòng)蛋白是細(xì)胞中兩種細(xì)絲的單體亞基：微絲，細(xì)胞骨架的三個(gè)主要組分之一，以及微絲，是肌細(xì)胞中收縮裝置的一部分。 因此，肌動(dòng)蛋白參與許多重要的細(xì)胞過(guò)程，包括肌肉收縮，細(xì)胞運(yùn)動(dòng)，細(xì)胞分裂和胞質(zhì)分裂，囊泡和細(xì)胞器運(yùn)動(dòng)，細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)，以及細(xì)胞連接和細(xì)胞形狀的建立和維持。

產(chǎn)品性質(zhì)

1.分子式（Molecular Formula）：C60H70N12O13S2

2.分子量（Molecular Weight）：1231.4

3.最大激發(fā)/發(fā)射波長(zhǎng)（Ex/Em）: 540～546/565～575nm

4.多肽序列（Sequence）: TRITC-bicyclic(Ala-DThr-Cys-cis-4-hydroxy-Pro-Ala-2-mercapto-Trp-4-hydroxy-5-amino-L   eu)(S-3 to 6)

5.外觀（Appearance）: 紫色粉末（凍干粉）

6.溶解性（Solubility）: 溶于 DMSO、DMF、甲醇或者乙腈水溶液（20%）

本品以1000×儲(chǔ)存液形式（溶于DMSO）提供，按照100μl/孔（96孔板），總共可做300T。

warbio 生物也提供粉末形式，濃度自行配置使用, 可直接溶于甲醇或DMSO配置成適當(dāng)濃度的儲(chǔ)存液。之后用PBS或PBS+1% BSA稀釋到合適的工作濃度。常用工作濃度范圍80-200nM。

注意事項(xiàng)：   

鬼筆環(huán)肽的分子量小，很容易通過(guò)細(xì)胞，不需要對(duì)細(xì)胞進(jìn)行冷丙酮和TRITON X-100處理。毒性較大，戴上手套操作。

自備實(shí)驗(yàn)材料

1.1 TRITC-鬼筆環(huán)肽（貨號(hào)LX4530）

1.2 1×PBS Buffer（pH 7.4）, for Cell Culture（貨號(hào) SH30256.01）

1.3 固定液（溶于PBS的4%多聚甲醛，pH 7.0）

1.4 破膜液（溶于PBS的0.5% Triton X-100）

1.5 抗熒光淬滅劑

1.6 （可選）即用型PI染色液（貨號(hào) 4209）

1.7 （可選）BSA, Standard Grade（貨號(hào) J8660）

1.8 蓋玻片密封液（透明指甲油）

操作步驟

1. 工作液準(zhǔn)備

1）對(duì)于TRITC-鬼筆環(huán)肽（貨號(hào)：LX4530）

本品以溶于甲醇的20μM儲(chǔ)存液形式提供，總量為300μl。按照100 nM的工作液濃度來(lái)?yè)Q算，可制備總量為60 ml的工作液。建議收到產(chǎn)品后，根據(jù)單次使用量，對(duì)母液進(jìn)行小量分裝，-20℃避光凍存，一年穩(wěn)定。

開始實(shí)驗(yàn)前，使用1×PBS緩沖液稀釋儲(chǔ)存液到需要的工作濃度。推薦工作濃度為：80~200nM。工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。

2）對(duì)于TRITC-鬼筆環(huán)肽（（貨號(hào)：LX4532）

Warbio生物以凍干粉形式提供，分子量為 1231.4，總量為 1mg。可先用甲醇或者DMSO充分溶解配制成20~100μM的儲(chǔ)存液。如，加入8.494ml甲醇到1mg鬼筆環(huán)肽即得到100μM等量的儲(chǔ)存液，根據(jù)單次使用量，進(jìn)行小量分裝，-20℃避光凍存，一年穩(wěn)定。

開始實(shí)驗(yàn)前，使用1×PBS緩沖液稀釋儲(chǔ)存液到需要的工作濃度。推薦工作濃度為：80~200nM。工作液現(xiàn)配現(xiàn)用。

2. 染色步驟

1）細(xì)胞爬片生長(zhǎng)24h，使其密度達(dá)到50%匯合度。

2）吸掉培養(yǎng)液，37℃預(yù)熱的1×PBS（pH 7.4）清洗細(xì)胞2次。

3）使用溶于PBS的4%甲醛溶液進(jìn)行細(xì)胞固定，室溫固定10min。

注意：避免固定劑中含有甲醇成分，因?yàn)榧状荚诠潭ㄟ^(guò)程中可能破壞肌動(dòng)蛋白。

4）室溫條件下，用PBS清洗細(xì)胞2~3次，每次10min。

5）室溫條件下，用丙酮（≤-20℃）脫水或者用0.5% Triton X-100溶液透化處理5min。

6）室溫條件下，用PBS清洗細(xì)胞2~3次，每次10min。

7）取200μl配制好的 FITC標(biāo)記鬼筆環(huán)肽工作液，覆蓋住蓋玻片上的細(xì)胞，室溫避光孵育30min（通常情況下，4℃~37℃孵育皆可）。

注意：為了降低背景，可于FITC標(biāo)記的鬼筆環(huán)肽工作液內(nèi)加入1% BSA；另外，孵育過(guò)程中為了避免溶液揮發(fā)，可將蓋玻片轉(zhuǎn)移到一個(gè)密封的容器內(nèi)。

8）用PBS清洗蓋玻片3次，每次5min。

9）使用200μl DAPI溶液（濃度：100 nM）對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行復(fù)染，約30s。

10）用PBS清洗蓋玻片，然后倒置在已經(jīng)滴有一滴Fluoromount-GTM 水溶性封片劑的載玻片上。使用紙巾輕輕檫掉多余封片劑，然后用指甲油永久封片。此法制備的標(biāo)本玻片可置于4℃避光保存，通常6個(gè)月內(nèi)可繼續(xù)做F-actin染色分析。

注意：也可以直接使用含有DAPI的抗熒光淬滅封片劑（合并步驟9）10），簡(jiǎn)化步驟。

11）熒光顯微鏡或者共聚焦顯微鏡下進(jìn)行熒光觀察，選擇FITC激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=496/516nm）和DAPI激發(fā)/發(fā)射濾片（Ex/Em=364/454nm）。

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