測定意義：

PEPC（EC 4.1.1.31）廣泛存在于動物、植物、微生物和細胞中，是催化磷酸烯醇式丙酮酸與二氧化碳反應生成草酰乙酸呈不可逆反應的酶，對三羧酸循環(huán)的運轉起重要調節(jié)作用。

測定原理：

PEPC催化磷酸烯醇式丙酮酸和CO₂生成草酰乙酸和HPO4^2-，蘋果酸脫氫酶進一步催化草酰乙酸和NADH生成蘋果酸和NAD⁺，在340nm測定NADH減少速率，計算PEPC活性。

組成：

自備儀器和用品：

紫外分光光度計、臺式離心機、可調式移液器、1 ml石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理：

1、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1ml提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

3、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、 分光光度計預熱30min以上，調節(jié)波長至340nm，蒸餾水調零。

2、 試劑五工作液的配制：將試劑五原液：試劑五稀釋液=1μl:329μl稀釋，用多少配多少。

3、 將試劑一、二、三、四和試劑五工作液置于37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)預熱5分鐘。

加樣表：

將上述試劑按順序加入1 ml石英比色皿中，立即混勻，加樣本的同時開始計時，340 nm波長下記錄初始吸光度A1和反應5分鐘后的吸光度A2。計算ΔA=A1-A2。

注意事項：如果一次性測定樣本數(shù)較多，可將試劑一、二、三、四、和試劑五工作液按比例配成混合液。

PEPC活性計算：

1、血清（漿）PEPC活力計算

單位定義：每毫升血清（漿）每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PEPC（nmol/min/ml））＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷V樣÷T=1624×ΔA

2、組織、細菌或細胞中PEPC活力計算

（1）按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每mg組織蛋白每分鐘消耗1nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PEPC（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=1624×ΔA÷Cpr

（2）按樣本鮮重計算

單位定義：每g組織每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PEPC（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V樣÷V樣總)÷T=1624×ΔA÷W

（3）按細菌或細胞密度計算：

單位定義：每1萬個細胞每分鐘消耗1 nmol NADH定義為一個酶活力單位。

PEPC（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V樣÷V樣總)÷T=3.248×ΔA

V反總：反應體系總體積，1.010×10^-3 L；ε：NADH摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.02 ml；V樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應時間，5 min；Cpr：樣本蛋白質濃度，mg/ml；W：樣本質量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。