測(cè)定意義：

線粒體是半自主性細(xì)胞器，不僅是細(xì)胞內(nèi)氧化磷酸化和合成三磷酸腺苷（ATP）的主要場(chǎng)所，為細(xì)胞的活動(dòng)提供能量，而且在許多生命活動(dòng)中具有重要調(diào)控作用。因此，準(zhǔn)確和全面分離保持正常活性的線粒體已經(jīng)成為許多研究的前提。

測(cè)定原理：

利用專門試劑溫和勻漿組織和細(xì)胞，再采用差速離心法從勻漿中分離完整線粒體；利用專門試劑，配合超聲波破碎線粒體，可以得到保持活性的線粒體酶。

試劑的組成和配制：

需自備的儀器和用品：

超聲波破碎儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。

提取步驟：

1、準(zhǔn)確稱取約0.1g組織或收集約500萬(wàn)細(xì)胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑四，用冰浴勻漿器或研缽研磨。

2、4 ℃ 600 g離心5min。

3、棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，4 ℃ 11000 g離心10min。

4、上清液即胞漿提取物，可用于研究線粒體蛋白向胞漿的釋放。

5、沉淀為完整線粒體。含有完整的內(nèi)膜和外膜，并具有線粒體的生理功能。可用于線粒體的生理功能等方面的研究。

6、在沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑四，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3秒，間隔10秒，重復(fù)30次），可用于線粒體酶活性測(cè)定。

7、在沉淀中加入200uL試劑三和2uL 試劑四，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3秒，間隔10秒，重復(fù)30次），可用于線粒體蛋白濃度測(cè)定。

注意事項(xiàng)

1、 分離線粒體和提取線粒體蛋白質(zhì)的所有步驟均需在冰上或4℃進(jìn)行，所用溶液需冰浴或4℃預(yù)冷。

2、 通常在分離線粒體時(shí)前后兩次離心速度選取600g和11,000g，如果希望純度更高，但對(duì)線粒體的得率要求不高，前后兩次離心速度可以采用1000g和3500g。

3、 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。