測定意義：

ACC在生物體內(nèi)催化乙酰輔酶A羧化生成丙二酰輔酶A，是脂肪酸和許多次生代謝產(chǎn)物合成的關(guān)鍵酶。ACC的活性在一定程度上決定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。

測定原理：

ACC能夠催化乙酰輔酶A、NaHCO₃和ATP生成丙二酰輔酶A、ATP和無機磷，通過鉬酸銨定磷法測定無機磷的增加量來測定ACC活性。

組成：

試劑四：粉劑×1 瓶, 4℃保存。用時加入25ml蒸餾水，溶解后4℃可保存一周。

試劑五：粉劑×1瓶, 4℃保存。用時加入25ml蒸餾水，溶解后4℃可保存一周。

試劑七：10μmol/ml 標(biāo)準(zhǔn)磷貯備液 10ml×1 瓶，4℃保存。

自備儀器和用品：

分光光度計、恒溫水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1 ml玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理:

1、細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴個）：提取液體積（ml）為500~1000：1的比例（建議500萬細菌或細胞加入1ml提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1ml提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟:

1、 分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至660nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 酶促反應(yīng)試劑的配制和預(yù)熱：在試劑二瓶中加入6.5ml試劑一，充分溶解混勻；在試劑三瓶中加入5ml蒸餾水，充分溶解混勻；將試劑一、二、三在37℃(哺乳動物)或25℃(其它物種)預(yù)熱10分鐘。

3、定磷試劑的配制：按H₂O: 試劑四:試劑五:試劑六=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷試劑

              應(yīng)為淺黃色，若無色則試劑失效，若是藍色則為磷污染，定磷劑現(xiàn)用現(xiàn)配。

注意：配試劑最好用新的燒杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。

4、0.5μmol/ml 標(biāo)準(zhǔn)磷應(yīng)用液配制：將試劑七20倍稀釋，即取 0.5ml試劑七加9.5蒸餾水，充分混勻。

5、酶促反應(yīng)

37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）準(zhǔn)確反應(yīng)30min后，90℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失），冷卻后，10000g 25℃離心5min，取上清

6、定磷

混勻，37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）水浴30min，冷卻至室溫，在 660nm處，蒸餾水調(diào)零，記錄各管吸光值A。標(biāo)準(zhǔn)管、空白管只要做一次即可，每個測定管需要設(shè)一個對照管。

注意：若測定管吸光值大于2，將樣品用提取液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后再進行測定，使吸光值小于2，可提高檢測靈敏度，計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

ACC活性計算：

1、按組織蛋白濃度計算：

定義：每小時每毫克組織蛋白產(chǎn)生1μmol無機磷的量為一個 ACC活力單位。

ACC (μmol/h/mg prot)=(C標(biāo)準(zhǔn)管×V總)×(A測定管-A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷

(V樣×Cpr)÷T=10×(A測定管-A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷Cpr

2、按樣本鮮重計算：

定義：每小時每g組織產(chǎn)生1μmol無機磷的量為一個 ACC活力單位。

ACC (μmol/h/g鮮重)=(C標(biāo)準(zhǔn)管×V總)×(A測定管-A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷

(W× V樣÷V樣總)÷T=10×(A測定管-A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)÷W

3、 按細菌或細胞密度計算：

定義：每小時每500萬細菌或細胞產(chǎn)生1μmol無機磷的量為一個 ACC活力單位。

ACC (μmol/h/10⁴ cell)=(C標(biāo)準(zhǔn)管×V總)×(A測定管-A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管）÷

(500× V樣÷V樣總)÷T=0.02×(A測定管-A對照管)÷(A標(biāo)準(zhǔn)管-A空白管)

C標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)管濃度，0.5μmol/ml；V總：酶促反應(yīng)總體積，0.5ml；V樣：加入樣本體積，0.05ml ；V樣總：加入提取液體積，1ml；T：反應(yīng)時間，0.5小時；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本鮮重，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500萬。