近日，上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院張大兵團(tuán)隊楊立桃課題組，在生物傳感器領(lǐng)域權(quán)威期刊《Biosensors and Bioelectronics》(IF: 10.618)在線發(fā)表了題為“PAM-free Loop-mediated Isothermal Amplification Coupled with CRISPR/Cas12a Cleavage (Cas-PfLAMP) for Rapid Detection of Rice Pathogens”的研究論文，首次結(jié)合核酸固相提取、LAMP等溫擴(kuò)增、CRISPR/Cas12a體外剪切和免疫試紙條，建立了一種現(xiàn)場快速核酸檢測技術(shù)體系Cas-PfLAMP，并成功應(yīng)用于田間水稻病原體（水稻白葉枯病，XOO；水稻條紋病毒病，RSV；水稻黑條矮縮病，RBSDV）快速檢測。上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院博士研究生朱早兵為本文的第一作者，生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院楊立桃教授為通訊作者。

水稻（Oryza sativa L.）是全球最重要的糧食作物之一。然而，水稻常見的病害，如：水稻白葉枯病（XOO）、水稻條紋病毒病（RSV）和水稻黑條矮縮?。?/span>RBSDV）等嚴(yán)重影響著水稻產(chǎn)量和稻米品質(zhì)，尤其是在中國、韓國和日本等亞洲國家。關(guān)于水稻病原菌的預(yù)防和快速診斷研究，前人已經(jīng)報道了多種檢測方法，如：生物接種法、電子顯微鏡法、熒光的免疫分析法、基于抗體的血清學(xué)診斷、熒光定量PCR法、重測序法等，然而，這些技術(shù)方法對于水稻病害預(yù)防和檢測存在一定不足，如：檢測周期長、準(zhǔn)確性差、靈敏度低等。

近年來，基于成簇的規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR/Cas）系統(tǒng)被廣泛應(yīng)用于基因組編輯和核酸檢測領(lǐng)域。CRISPR/Cas12a (Cpf1)等具有反式切割活性（trans-activity）以及向?qū)?/span>RNA (sgRNA)的雙鏈DNA的特異性識別和切割活性的特點，為新一代快速核酸檢測技術(shù)開發(fā)打開了一扇門。如：張鋒教授團(tuán)隊的夏洛克檢測系統(tǒng)SHERLOCK(Cas13)，Doudna教授團(tuán)隊的DETECTR系統(tǒng)(Cas12 or Cas14)，王金/趙國屏教授團(tuán)隊開發(fā)的HOLMES系統(tǒng)(Cas12)等。該研究，作者開發(fā)了一種不依賴于間隔區(qū)相鄰基序(PAM)、CRISPR/FnCas12a剪切輔助的環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（loop-mediated isothermal amplification, LAMP）檢測技術(shù)，Cas-PfLAMP。Cas-PfLAMP巧妙的結(jié)合了LAMP等溫擴(kuò)增、FnCas12a蛋白的反式切割活性的優(yōu)點，有效提高了Cas-PfLAMP檢測的靈敏度和特異性，克服了傳統(tǒng)的LAMP檢測假陽性高的缺點。該研究以三種水稻病原體（XOO，RSV，RBSDV）為對象，設(shè)計了病原菌特異性的引物和sgRNA，系統(tǒng)評價了Cas-PfLAMP技術(shù)的特異性、靈敏度和準(zhǔn)確性，結(jié)果表明Cas-PfLAMP能夠準(zhǔn)確區(qū)分三種水稻病原菌，靈敏度達(dá)到了3-9個拷貝/反應(yīng)。

圖1.Cas-PfLAMP工作原理示意圖

同時，研究人員還發(fā)明了一種適合于植物葉片核酸固相提取新方法，將DNA/RNA固定在葉片組織上，在5~10分鐘內(nèi)可以完成96個水稻葉片樣本的核酸固相提取。研究人員將Cas-PfLAMP技術(shù)、固相核酸提取方法、側(cè)向流動試紙條(LFS)優(yōu)化組合，搭建了一套田間快速可視化檢測平臺，并成功用于田間3種水稻病原體（XOO，RSV，RBSDV）的現(xiàn)場檢測。從樣本采集，核酸提取，到最后結(jié)果讀出，全程檢測時長約為60分鐘。田間樣本測試結(jié)果與常規(guī)的PCR檢測結(jié)果完全吻合，證明了Cas-PfLAMP在田間快速檢測時具有準(zhǔn)確性高、特異性好。研究結(jié)果表明，Cas-PfLAMP檢測系統(tǒng)性能優(yōu)良，不僅適用于水稻病原體的現(xiàn)場快速檢測，還可以進(jìn)一步擴(kuò)展應(yīng)用于其他植物病原體、動物疫病等核酸檢測領(lǐng)域。該研究也為核酸分子快速、可視化檢測提供了新的思路。

圖2.Cas-PfLAMP田間快速可視化檢測平臺工作流程示意圖

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